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Diagnostik der Lyme-Borreliose

Eine Zusammenstellung von Aufsätzen von LL Bakken, PK Coyle und KB Liegner

übersetzt und editiert [Zusätze] und Links von
Joachim Gruber

Inhalt

  1. Coyle PK, Borrelia burgdorferi Infektion: Klinische Diagnostische Techniken
  2. Bakken LL, Callister SM, Wand PJ, Schell RF, Vergleich der Test-Resultate zur Feststellung von Lyme-Borreliose in 516 Laboratorien
  3. U. Everth U, Weller U, Waldherr A, Selected Aspects of Serology of Borrelia burgdorferi sensu lato
  4. Liegner KB, LYME BORRELIOSE: Die vernünftige Suche nach Antworten
  5. International Lyme and Associated Diseases Society, Positionspapier zur Diagnose von Lyme
  6. Honegr K et al., Criteria for evaluation of immunoblots using Borrelia afzelii, Borrelia garinii and Borrelia burgdorferi sensu stricto for diagnosis of Lyme borreliosis

Immunological Investigations 26(1&2):117-128 (1997)

Borrelia burgdorferi Infektion: Klinische Diagnostische Techniken

Borrelia burgdorferi infection: clinical diagnostic techniques

Coyle, PK

Department of Neurology, School of Medicine, State University of New York at Stony Brook, Stony Brook, NY 11794

.....

Das Kapitel "Gegenwärtige diagnostische Techniken" beginnt mit der Betonung, daß die Diagnose von Lyme-Borreliose letztendlich eine klinische sein muß. In ihrer Tabelle IV bezeichnet Pat Coyle die Labortests als experimentell [d.h. im Entwicklungsstadium] und nützlich zur Unterstützung der Diagnose. Sie sind sehr willkommen, weil außer dem Erythema chronicum migrans [ECM, Wanderröte] keines der Symptome ausreichend charakteristisch sei, als pathognomischer Marker für eine Borrelia burgdorferi Infektion zu dienen. Labortests verwenden Proben von Körperflüssigkeiten, wie Blut, Liquor und Gelenkflüssigkeit. Darüberhinaus entnimmt man für solche Tests Biopsie-Proben von Haut, dem Herzmuskel und dem Synovium [Gelenkgewebe]. 

Kulturen

Eine Kultur des Erregers wird als der "Goldstandard" (bester Bezugsstandard) bei der Diagnose einer Infektion angesehen. Unglücklicherweise ist es schwierig, B. burgdorferi in menschlichen Körperflüssigkeiten und Organen zu kultivieren oder anzufärben (mit Ausnahme von Biopsie-Proben des frühen ECM, die in 60 - 86% der Fälle Spirochäten nachweisen (34). Vgl. dagegen eine neuere Studie (35), in der Haut-Kulturen nur in 29% ein positives Ergebnis erbrachten).

Beispiele für andere Kulturen von menschlichen Proben: Stony Brook erreichte es in den Jahren 1994 - 1997, 6 kultur-positive Proben vom Liquor zu züchten. Alle 6 Fälle hatten Lyme-Hinrhausentzündung, eine frühe Erscheining einer im Körper ausgebreiteten neurologischen Erkrankung. Das Kultur-Protkoll: 0.5 Kubikzentimetern Liquor wurden in 4.5 Kubikzentimeter BSK-H Medium (der Firma Sigma Chemical Co., St Louis, MO) eingebracht und dann bei 33 C bis zu 12 Wochen gehalten. Der Liquor wurde alle paar Wochen mit Dunkelfeld-Mikroskopie auf Spirochäten untersucht. Spirochäten brauchten typischerweise wenigstens 6 Wochen, bis sie in feststellbaren Mengen im Liquor vorlagen. Der Nachweis, daß es sich um B. burgdorferi handelte, wurde mit PCR erbracht. Interessanterweise zeigte sich eine geringe Heterogenität der DNA/RNA, sodaß vermutet wird, daß ins Nervensystem nur spezielle Stämme eindringen.

Serologie

Der Nachweis von Antikörpern gegen B. burgdorferi ist gegenwärtig der gewöhnlich angewendete Labortest, obwohl -wie die Aufstellung in Tabelle V zeigt- unglücklicherweise eine Reihe von Problemen dabei bestehen. Es treten falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse auf. Die Tabelle V gibt als Grund für falsch-positive Resultate und für falsch-negative Resultate Die Variationsbreite ist verursacht durch fehlende [weil nicht bekannte] Standards bei der Manche Labors erbrachten nur geringe Verläßlichkeit sowohl bei identischen als auch bei unterschiedlichen Proben (36, 37, 38, 39).

Ein Teil (aber gewiß nicht alle) der seronegativen Patienten haben meßbare anti-B. burgdorferi Antikörper im Blutkreislauf, die in Immunkomplexen gebunden sind [die vor einer Auftrennung der Komplexe in der konventionellen Serologie nicht registriert werden] (40, 41).

Die ganz überwiegend benutzte serologische Untersuchungsmethoden, ELISA (enzyme linked immuno assay) hat die IFA's (indirect immunofluorescenct assays) weitgehend ersetzt. Gegenwärtig verwenden ELISA's

Die Bewertung der gemessenen Konzentration als positiv oder negativ für B. burgdorferi trifft man im Vergleich zu einer negativen Kontroll-Probe, also z.B. nennt man ein Testergebnis positiv, wenn seine optische Dichte 3 Standard-Abweichungen über der mittleren optischen Dichte der Kontrollprobe liegt. Die Empfindlichkeit kann man auf diese Weise auf vernünftige Werte bringen, hat aber aus den angegebenen Gründen ein Problem dabei, den Nachweis ausreichend spezifisch zu führen, d.h. allein B. burgdorferi aufzuzeigen.

Der Western-Immunoblot (WB) gestattet es, die spezifische Aktivität von Antikörpern zu untersuchen. Aguero-Rosenfeld (42) zeigte, daß die Anzahl der Banden auf einem IgM oder IgG Western Blot einen Bezug zur Dauer der Lyme-Borreliose hat und zu ihrer Ausbreitung im Körper (im Sinne des Verlassens des Stadiums des ECM).

Die Kriterien für einen positiven IgM oder IgG Western Blot, welche das Center for Disease Control und die Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors (ASTPHLD) empfohlen haben, könnten sich als zu restriktiv herausstellen. Es gibt Fälle, bei denen die B. burgdorferi Kultur positiv ausfiel und die nach diesen Kriterien niemals Western Blot positiv waren.

Diese Kriterien

Intrakompartment-Antikörper-Synthese. In der Natur der Antikörper-Tests liegt es, daß sie nur eine Aussage macht darüber, daß der Körper die Antigene wahrgenommen hat, nicht aber darüber, daß eine aktive Infektion vorliegt. Demgegenüber ist eine B. burgdorferi-spezifische Antikörper-Erzeugung im Kompartment der Gelenke oder der Rückenmarkshaut (die sog. intrathekale Antikörper-Produktion) ein indirekter Labornachweis für eine aktive Infektion. Wenn man die Produktion im Blut-Kompartment dagegenhält, sieht man in diesem Fall, daß Antikörper vorzugsweise im Liquor oder in der Gelenkflüssigkeit erzeugt werden, und das beweist bis auf geringe Ausnahmen bei unbehandeltem Patient eine B. burgdorferi-Infektion des Zentralnervensystems oder der Gelenke.

[
Dies ist -entsprechend der obigen Charakterisierung der Antikörper-Tests- ein hinreichender Beweis, aber kein notwendiger, d.h. wir können eine aktive Neuroborreliose haben, auch ohne Antikörper in unserem Liquor zu erzeugen - eben dann, wenn unser Körper die Antigene nicht wahrgenommen hat.
Literatur

]

In ihrer im Mosby Year Book veröffentlichten Arbeit (44) geht Dr. Coyle auf Einzelheiten ein, wie sie diese Intrakompartment-Antikörper-Synthese, auf Englisch

nachweist. Eine Methode besteht darin, zwei (normierte) ELISA-Ergebnisse zu vergleichen:
  1. das eine ist mit Liquor (oder Gelenkflüssigkeit) bestimmt worden,
  2. das andere mit Serum.
Jedes dieser beiden Ergebnisse ist normiert in dem Sinne, daß es eine Verhältniszahl ist aus dem ELISA-Wert für IgG im Zähler und dem Wert für alle Immunglobuline zusammengenommen (die totale Immunglobulin-Konzentration darstellend) im Nenner. In mathematischer Form für Liquor geschrieben:
 

wobei

IgG(Bb) = B.burgdorferi-spezifische Immunglobulin G-Konzentration,

Igtotal = gesamte Immunglobulin-Konzentration,

(...)Liquor = Wert der Klammer im Liquor,

(...)Serum = Wert der Klammer im Serum.

Polymerase Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR)

Die PCR wird benutzt, um B. burgdorferi DNA/RNA in einer Reihe von Proben zu bestimmen, angefangen von Körperflüssigkeiten (Serum, Liquor, Gelenkflüssigkeit, Urin, Gesamtblut und Plasma , wie in den Veröffentlichungen (45, 46, 47, 48) dargestellt) bis hin zu Gewebeproben. Je nach Labor und Wissenschaftler gibt es positive Ergebnisse bei einem großen oder kleineren Bruchteil der Borreliosefälle. Positive Ergebnisse findet man [Abnormalitäten im Liquor sind mehr üblich bei früher als bei später Borreliose. Sie könnten sich dann in einer erhöhten Konzentration (Pleocytose) der mononukleären Zellen (Monozyten, Leukozyten) äußern, einem erhöhtem Proteingehalt und möglicherweise in der erwähnten intrathekalen Antikörperproduktion. PCR-Nachweise im Liquor sind notorisch schlecht. Selbst bei einer stark ausgeprägten Borreliose-Hirnhautentzündung ergeben weniger als die Hälfte der Proben ein positives PCR-Ergebnis. J. Gruber]

Die Qualität der Primer bestimmt das Ergebnis. Es wurden Primer zum Nachweis von

Vorteil der Methode::

  1. Die Auflösung kann sehr hoch sein: eine Spirochäte in einer klinischen Probe.
  2. PCR-nachgewiesene DNA bedeutet nicht, daß lebende Organismen vorliegen. Aber Malawista und Mitarbeiter (50) vermuten, daß PCR-positive Ergebnisse nach wirksamer Antibiotika-Behandlung verschwinden.
Nachteil der Methode:
  1. Fehlende Standardisierung für Routine-Untersuchungen.
  2. Protokolle und Primer sind noch nicht auf Empfindlichkeit und Spezifität optimiert, z.B. mit Liquor liegt die Empfindlichkeit auf B. burgdorferi weit unter 100%.
  3. Geringste Verunreinigung im Labor können falsch-positive Resultate erzeugen.
Im Kapitel Techniken in der Entwicklung bewertet Dr. Coyle eine neue in der Forschung befindliche Generation von Tests. Man versucht, die serologischen Tests durch die Auswahl der Primer-Antigene zu verbessern (51, 52).

Zusammenfassung

Es gibt zwei noch ungelöste diagnostische Aufgaben bei der Lyme-Borreliose:
  1. die Bestimmung einer aktiven Infektion und
  2. eine verläßliche weithin anwendbare Antikörper-Bestimmungsmethode (screening assay).
Für den ersten Problemkreis werden standardisierte Techniken entwickelt Im zweiten Problembereich des empfindlichen und spezifischen Antikörper-Nachweises sucht man nach verbesserten Antigen-Quellen für ELISA und WB. Dies wären rekombinant herstellbare B. burgdorferi Proteine, die für das Immungeschehen verantwortlich sind.

Literaturhinweise

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67. Coyle PK, Schutzer SE, Deng Z et al., Neurol 1995;45:2010-2015.

[68. Barkley M., Harris N, Szantyr B, 10th Annual Int. Conf. On Lyme Borreliosis, National Institue Of Health, Bethesda, Md. April 28-30, 1997.]

J Clin Microbiol 1997 Mar;35(3):537-43

Vergleich der Test-Resultate zur Feststellung von Lyme-Borreliose in 516 Laboratorien (Teilnehmern am Wisconsin State Laboratory of Hygiene/College of American Pathologists Proficiency Testing Program.)

-Interlaboratory comparison of test results for detection of Lyme disease by 516 participants in the Wisconsin State Laboratory of Hygiene/College of American Pathologists Proficiency Testing Program.

Bakken LL, Callister SM, Wand PJ, Schell RF

Department of Continuing and Vocational Education, University of Wisconsin, Madison 53706, USA.

Im Jahr 1991 berichteten wir, daß 55 % der Labors, der am Wisconsisn Qualitätstest Program teilnahmen, Serum-Proben von Lyme-Borreliose-Kranken mit Antikörpern gegen Borrelia burgdorferi (dem Borreliose-Bakterium, D. Übers.) nicht richtig identifizieren konnten.

Die Absicht der jetzt vorgelegten Studie war es, zu bestimmen, ob die Genauigkeit der Lyme-Borreliose-Testergebnisse sich verbessert hat, die von etwa 500 Teilnehmern an der Lyme-Borreliose-Übersichtstudie des Landeshygieneinstituts/Kollegium der Amerikanischen Pathologen abgegeben wurden.

Von 1992 bis 1994 wurden 50 Serum-Proben den Teilnehmern an der Studie zugesandt. Jedes Labor erhielt 28 Serum-Proben von Menschen mit Lyme entsprechend der Definition des Zentrums für Krankheitsbekämpfung und -vorbeugung (Center for Disease Control and Prevention, CDC) und 22 Serum-Proben von gesunden Menschen.

Unglücklicherweise hat sich die Serodiagnostik der Lyme-Borreliose der Teilnehmer nicht verbessert.

Diese Ergebnisse legen nahe, daß bindendere Kriterien angewendet werden müssen bei der Zulassung und deren Verlängerung von kommerziell verfügbaren Test-Zubereitungen für die Serodiagnostik von Lyme-Borreliose.

VIII. International Potsdam Symposium, 23. February, 2005

Selected Aspects of Serology of Borrelia burgdorferi sensu lato
deutsche Fassung: Borreliose-Serologie (im Cache)

U. Everth, U. Weller, A. Waldherr

Laborzentrum Berlin, Landgrafenstr. 16, D - 10787 Berlin, Germany, Telephone: +49 30 301 188-28

ABSTRACT
Lyme-Borreliosis is gaining in importance as an emerging disease. Estimates of incidences for central Europe reach 237 per 100.000 per year and in some regions are as high as 1.5% per year. The spectrum of symptoms is complex and clinical diagnosis in the case of multiple "general symptoms" is difficult and in many cases not reliable.

Antibody-based diagnosis is often not able to solve diagnostic problems either, due to "false-positive" and "false-negative" results.

Generally a two-step serodiagnosis - similar to HIV-diagnostics - is used:

  1. If the result of the screening-assay (ELISA, i-IFT, HAT or KBR) points towards the presence of antibody
  2. it is confirmed by Western-/ Immuno- Blot.
The diagnosis is established by the presence of certain bands.

It is shown that the diagnostic value of test-kits from different manufacturers may differ considerably. This may even result in missing the diagnosis (Lyme) in certain cases- if a non-appropriate system is used.

This poster demonstrates possible influences on serologic diagnostics. Examples are given by blot-stripes from the daily routine.

Journal of Clinical Microbiology, Aug 1993, p. 1961-1963

LYME BORRELIOSE: Die vernünftige Suche nach Antworten

Lyme Borreliosis: The sensible pursuit of answers

Kenneth B. Liegner, M.D., P.C.

.....

Viele Ärzte und Wissenschaftler räumen ein, daß es seronegative Lyme-Borreliose gibt, behaupten aber, daß es sich um ein seltenes Phänomen handelt. Tatsächlich wurden in Forschungszentren bei Studien seronegative Patienten, deren Symptome mit denen von Lyme-Borreliose übereinstimmen, ausdrücklich ausgeschlossen. Es ist möglich, daß dies ein schwerer konzeptioneller und methodologischer Fehler ist. Das gegenwärtige Verständnis der menschlichen Immunreaktion auf B. burgdorferi ist rudimentär.

Die Verfügbarkeit von direkten Antigenuntersuchungen, die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) und andere Ansätze zum direkten Nachweis des Erregers werden, wenn sie klinisch bestätig sind, zu einer rationaleren pharmakologischen Therapie der Lyme-Borreliose führen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden helfen zu erkennen, was pragmatische Ärzte seit langem durch das sorgfältige Studium ihrer Patienten erkannt haben: daß Seronegativität ein tatsächliches Phänomen bei Lyme-Borreliose ist, das sowohl im Früh- als auch im Spätstadium der Erkrankung auftritt (4, 21).

Wenn seronegative Lyme-Borreliose anerkannt wird, macht das eine empirische Behandlung von Patienten, bei denen der klinische Verdacht auf Lyme-Borreliose besteht, zwingend notwendig.

Literaturhinweise

3. Coyle PK, Belman AL, Krupp LB, B. burgdorferi-specific immune complexes in cerebrospinal fluid, abstr. 167, p. A29. Program Abstr. 5th Conf. Lyme Borreliosis. 1992.

4. Coyle PK. Schutzer SE, Belman AL, Krupp LB, Deng Z, Cerebrospinal fluid immunologic parameters in neurologic Lyme disease, p. 31-43. In S. E. Schutzer (ed), Lyme disease molecular and immunologic approaches. Current communications in cell and molecular biology . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.1992

5. Dorward DW, Huhuenel ED, Davis G, Garon CF, Extracellular Borrelia burgdorferi proteins interact with non-borrelia-directed IgM antibodies. abstr. 219, p. A38. Program Abstr. 5th Int. Conf. Lyme Borreliosis, 1992.

10.Hardin JA, Steere AC, Malawista SE, Immune complexes and the evolution of Lyme arthritis. Dissemination and localization of abnormal C1q binding activity. N. Engl. J. Med 1979;301:1358-1363.

21. Liegner KB, Dorward DW, Garon CF. Lyme borreliosis (LB) studied with the Rocky Mountain Laboratory (RML) antigen-capture assay in urine. abstr. 104, p. A18. Program Abstr. 5th Int. Conf. Lyme Borreliosis, 1992.

32. Schutzer SE, Coyle PK, Brunner M, Specific serum immune complexes in Lyme disease. abstr. 135, p. A24. Program Abstr. 5th Int. Conf. Lyme Borreliosis, 1992.

Positionspapier zur Diagnose von Lyme

International Lyme and Associated Diseases Society

Epidemiol Mikrobiol Imunol. 2001 Nov;50(4):147-56.

[Criteria for evaluation of immunoblots using Borrelia afzelii, Borrelia garinii and Borrelia burgdorferi sensu stricto for diagnosis of Lyme borreliosis]

[Article in Czech]

Honegr K, Havlasova J, Gebousky P, Dostal V, Pellantova V, Skrabkova Z, Hulinska D.

Infekcni klinika FN, Hradec Kralove.

The immunoblot was prepared from genotypes Borrelia afzelii (KC 90), Borrelia garinii (M 192) and Borrelia burgdorferi sensu stricto (B 31). Sera of

In class IgM in the group of patients significantly more frequently antibodies against were found.

In class IgG there were antibodies against

Based on the assembled results by means of discrimination analysis and logistic regression
  1. the most suitable combinations of antigens for evaluation of immunoblots in different genotypes were determined.
  2. Furthermore evaluation was suggested using a combination of antigens of several genotypes which led to an increased sensitivity and specificity of the immunoblot.
  3. Tables were prepared for easier evaluation of newly examined sera samples.


PMID: 11769176 [PubMed - indexed for MEDLINE]


 

Boston Biomedica, Inc. Announces New Lyme Disease Test

In a significant scientific breakthrough, scientists recently discovered 6 surface proteins on Borrelia burgdorferi that remain constant (i.e. do not change due to "antigenic variation" like the Outer surface proteins, OspA, ... OspC). Scientists call these "invariable regions" (IR), which are termed IR1-6. One IR, IR6 is found in all strains of the Lyme disease pathogen and induces a strong immune response in infected patients. The C6 Lyme Peptide ELISA (C6 LPE) detects antibodies to the IR6 in infected patients (source: Lyme Disease Foundation).

Siehe auch C6 Lyme Peptide Elisa.


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Stand: 30. September 2011.
Joachim Gruber.